protokoll

Protokoll zur SDS-PAGE

Ziel
Versuchsplanung
Vorgehen

1. Geraete bereitstellen

2. Loesungen herstellen
(!Die Lösungen müssen im Praktikum NICHT hergestellt werden, sie wurden schon vorbereitet!)

2.1 Puffer
2.1.1 Trenngelpuffer (Lower Gel Buffer)
2.1.2 Sammelgelpuffer (Upper Gel Buffer)
2.1.3 Laufpuffer (Electrophoresis Buffer)
2.1.4 3x reduzierender Proben Puffer (3x Reducing Buffer)

2.2 Konzentrate

2.3 Coomassie Faerbung
2.3.1 Faerbeloesung
2.3.2 Entfaerbeloesung

2.4 Silber Faerbung
2.4.1 Fixation
2.4.2 Sensitizing
2.4.3 Washing
2.4.4 Silver Reaction
2.4.5 Washing
2.4.6 Developing
2.4.7 Stopping

3. Gelelektrophorese durchfuehren

3.1 Platten bereitstellen

3.2 Gele herstellen
3.2.1 Trenngel
3.2.2 Sammelgel

3.3 Gele abfuellen

3.4 Gelplatten einspannen

3.5 Laufpuffer einfuellen

3.6 Gele nach Beladungsschema beladen

3.7 Elektrophorese

3.8 Gele entnehmen

4. Faerbung

4.1 Coomassie Faerbung

4.2 Silber Faerbung

5. Gel Foto

Ziel:

Proteinnachweis mittels SDS-PAGE und anschliessender Coomassie Faerbung sowie Silber Faerbung.

Versuchsplanung:

Im Versuch werden 2 Gele parallel hergestellt. Jedes Gel wird bis auf die Faerbung gleich behandelt. Als Probe dient ein Zelllysat (PC12-Zellen). Dieses wird in 6 verschiedenen Konzentrationen auf das Gel aufgetragen.

Bei jeder SDS-PAGE muessen Geldicke, Probenmenge und Kammgroesse bestimmt werden.

Die Geldicke wird nach der zu erwartenden Proteingroesse gewaehlt. Im nachfolgenden Versuch wird ein 12.5 %iges (Anteil Acrylamid/Bisacrylamid) Trenngel und ein 4 %iges Sammelgel eingesetzt.

Weiter muss für das Gel ein Beladungsmuster entworfen werden. Von der Zelllysat-Stammloesung werden 6 unterschiedliche Volumina entnommen und auf das Gel geladen. Jedes Gel muss zusaetzlich eine Markerspur enthalten. Der Marker wird je nach der zu erwartetenden Proteingroesse gewaehlt. Im Versuch wird sowohl ein HM (high molecular marker) als auch ein LM (low molecular marker) eingesetzt, um einen moeglichst grossen Protein-Bereich abdecken zu koennen. Bei der Coomassie Faerbung werden als Marker HM C / LM C und bei der Silber Faerbung die Marker HM S / LM S eingesetzt. Die Marker der Silber Faerbung sind 5fach verdünnter als die der Coomassie Faerbung, da die Silber Faerbung 5 mal sensitiver ist als die Coomassie Faerbung. Von den Markern werden jeweils 10 µl aufgetragen.

Die Kammgroesse (S, M oder L) richtet sich nach der aufzutragenden Probenmenge sowie nach der Geldicke. Je nach Kammgroesse entstehen unterschiedlich voluminoese Taschen.

Vorgehen:

1. Geraete bereitstellen
2. Loesungen herstellen
3. Gelelektrophorese durchfuehren
4. Faerbung
5. Gel Foto

1. Geraete bereitstellen:

Fuer den Versuch werden folgende Geraete verwendet:

- Kuehlschrank 4 °C
- Tiefkuehler –20 °C
- Magnetruehrer
- pH-Meter
- Schuettler
- Thermoblock
- Vortex
- Zentrifuge

2. Loesungen herstellen:

Folgende Loesungen werden im Versuch gebraucht:

Puffer
- Trenngelpuffer
- Sammelgelpuffer
- Laufpuffer
- 3x reduzierender Proben Puffer

Konzentrate

Coomassie Faerbung
- Faerbeloesung
- Entfaerbeloesung

Silber Faerbung
- Fixation-Loesung
- Sensitizing-Loesung
- Silver Reaction-Loesung
- Developing-Loesung
- Stopping-Loesung

Es werden jeweils Stock-Loesungen hergestellt.

2.1 Puffer:

2.1.1 Trenngelpuffer (Lower Gel Buffer):

pH: 8.8

Menge: 100 ml

Substanzen:
- 1.5 M Tris
- 0.4% SDS
- Wasser deionisiert

Durchfuehrung:
1. 18.17 g Tris und 0.40 g SDS in ca. 90 ml deionisiertem Wasser aufloesen
2. pH kontrollieren
3. pH mit 1 M NaOH / 1 M HCl einstellen
4. mit deionisiertem Wasser auf 100 ml ergaenzen

Lagerung:
- Kuehlschrank 4°

2.1.2 Sammelgelpuffer (Upper Gel Buffer):

pH: 6.7

Menge: 100 ml

Substanzen:
- 0.5 M Tris
- 0.4% SDS
- Wasser deionisiert

Durchfuehrung:
1. 6.05 g Tris und 0.40 g SDS in ca. 90 ml deionisiertem Wasser aufloesen
2. pH kontrollieren
3. pH mit 1 M NaOH / 1 M HCl einstellen
4. mit deionisiertem Wasser auf 100 ml ergaenzen

Lagerung:
- Kuehlschrank 4°C

2.1.3 Laufpuffer (Electrophoresis Buffer):

pH: 8.3

Menge: 1000 ml

Substanzen:
- 0.25 M Tris
- 2 M Glycin
- 1% SDS
- Wasser deionisiert

Durchfuehrung:

10x Laufpuffer herstellen
1. 30.28 g Tris abwaegen
2. 150.14 g Glycin zugeben
3. 10.0 g SDS zugeben
4. in ca. 950 ml deionisiertem Wasser aufloesen
5. pH kontrollieren
6. pH mit 1 M NaOH / 1 M HCl einstellen
7. mit deionisiertem Wasser auf 1000 ml ergaenzen

10x Laufpuffer zu 1x Laufpuffer verduennen
8. 100 ml 1x Laufpuffer mit 900 ml deionisiertem Wasser mischen

Lagerung:
- Kuehlschrank 4°C

2.1.4 3x reduzierender Proben Puffer (3x Reducing Buffer):

pH: 6.75

Menge: 1000 ml

Substanzen:
- 65 mM Tris
- 4% SDS
- 20% (v/v) Glycerin
- 10% (v/v) beta-Mercaptoethanol
- Bromphenolblau
- Wasser deionisiert

Durchfuehrung:
1. 7.87 g Tris abwaegen
2. 4.0 g SDS zugeben
3. 20.0 g Glycerin zugeben
4. 10.0 g beta-Mercaptoethanol zugeben
5. in ca. 950 ml deionisiertem Wasser aufloesen
6. pH kontrollieren
7. pH mit 1 M NaOH / 1 M HCl einstellen
8. 1 Spatelspitze Bromphenolblau zugeben
9. mit deionisiertem Wasser auf 1000 ml ergaenzen

Lagerung:
- Tiefkuehler –20 °C

2.2 Konzentrate:

Substanzen:
- Zelllysat
- Wasser deionisiert
- 3x RB (3x Reducing Buffer)

Durchfuehrung:
Insgesamt werden 6 verschiedene Zelllysat-Konzentrate, nach folgendem Schema, hergestellt.

Tab. 1: Schema Zelllysat-Konzentrate

Konzentrat Nr. 1 2 3 4 5 6

Zelllysat [µl] 10 20 30 40 60 80

3x Reducing Buffer [µl] 5 10 15 20 30 40

Auftrage-Volumen [µl] 15 30 45 60 90 120

Tab. 2: Schema Marker

Marker	LM C	HM C	LM S	HM S
Markerloesung [µl]	10	10	10	10
3x Reducing Buffer [µl]	5	5	5	5
Auftrage-Volumen [µl]	15	15	15	15

Zusatz:
Vereinfacht koennte eine Zelllysat-Stammloesung (SL), bestehend aus 240 µl Zelllysat und 120 µl 3x Reducing Buffer hergestellt werden. Von dieser Stammloesung koennen dann 6 unterschiedliche Volumina entnommen werden.

Tab. 3: Schema Zelllysat-Stammloesung

Konzentrat Nr.	1	2	3	4	5	6
Volumen [µl]	5	10	15	20	30	40

Lagerung:
- Tiefkuehler –20 °C

2.3 Coomassie Faerbung:

2.3.1 Faerbeloesung:

Substanzen:
- Coomassie brilliant blue G250
- Coomassie brilliant blue R250
- Methanol
- Wasser Millipore
- Essigsaeure, konzentriert

Durchfuehrung:
1. 0.5 g Coomassie brilliant blue G250 in 100 ml Methanol loesen
2. 0.5 g Coomassie brilliant blue R250 in 100 ml Wasser Millipore loesen
3. beide Loesungen mischen
4. 20 ml Essigsaeure, konzentriert zugeben
5. durch Faltenfilter filtrieren

Lagerung:
- Raumtemperatur

2.3.2 Entfaerbeloesung:

Substanzen:
- Essigsaeure
- Methanol
- Wasser Millipore

Durchfuehrung:
1. 30 ml Essigsaeure und 100 ml Methanol mischen
2. Volumen der Loesung mit Wasser Millipore auf 400 ml ergaenzen

Lagerung:
- Raumtemperatur

2.4 Silber Faerbung:

Silberfaerbungs-Kit
Von jeder Loesung werden 250 ml hergestellt. Die Loesungen koennen nach Gebrauch wieder in die Flasche zurueckgeschuettet werden. Frisch hergestellte Loesungen (nicht laenger als 24h) ergeben die besten Resultate.

Silver Staining Protocol for Proteins

2.4.1 Fixation:

30 Minuten

Substanzen:
- Ethanol
- Eisessig
- Wasser deionisiert

Durchfuehrung:
1. 100 ml Ethanol und 25 ml Eisessig mischen
2. mit deionisiertem Wasser auf 250 ml ergaenzen

Lagerung:
- Raumtemperatur

2.4.2 Sensitizing:

30 Minuten

Substanzen:
- Ethanol
- Glutardialdehyd (25% w/v)
- Natriumthiosulfat (5% w/v)
- Natriumacetat (17 g)
- Wasser deionisiert

Durchfuehrung:
1. 75 ml Ethanol, 1.25 ml Glutardialdehyd und 10 ml Natriumthiosulfat mischen
2. 17 g Natriumacetat (1 Paeckchen) zugeben
3. mit deionisiertem Wasser auf 250 ml ergaenzen

Lagerung:
- Raumtemperatur

2.4.3 Washing:

3 x 5 Minuten

Substanzen:
- Wasser deionisiert

2.4.4 Silver Reaction:

20 Minuten

Substanzen:
- Silbernitratloesung (2.5% w/v)
- Formaldehyd (37% w/v)
- Wasser deionisiert

Durchfuehrung:
1. 25 ml Silbernitratloesung und 0.1 ml Formaldehyd mischen
2. mit deionisiertem Wasser auf 250 ml ergaenzen

Lagerung:
- Raumtemperatur, unter Lichtausschluss

2.4.5 Washing:

2 x 1 Minute

Substanzen:
- Wasser deionisiert

2.4.6 Developing:

2 x 5 Minuten

Substanzen:
- Natriumcarbonat (6.25 g)
- Formaldehyd (37% w/v)
- Wasser deionisiert

Durchfuehrung:
1. 6.25 g Natriumcarbonat (1 Paeckchen)
2. 0.05 ml Formaldehyd zugeben
3. mit deionisiertem Wasser auf 250 ml ergaenzen

Lagerung:
- Raumtemperatur

2.4.7 Stopping:

10 Minuten

Substanzen:
- EDTA-Na₂ • 2H₂O (3.65 g)
- Wasser deionisiert

Durchfuehrung:
1. 3.65 g EDTA-Na₂ • 2H₂O (1 Paeckchen)
2. mit deionisiertem Wasser auf 250 ml ergaenzen

Lagerung:
- Raumtemperatur

3. Gelelektrophorese durchfuehren

3.1 Platten bereitstellen

- Glasplatten und Plastikteile desinfizieren.
- Glasplatten, durch Spacer getrennt, zusammenschrauben und in die Apparatur einspannen.
- Durch Einfuellen von Wasser zwischen die Platten kann kontrolliert werden, ob die Apparatur dicht ist.

3.2 Gele herstellen

3.2.1 Trenngel 12.5%

Tab. 4: Zusammensetzung Trenngel

	15.0 ml
30% Acrylamid/BIS	6.25 ml
Wasser deionisiert	3.75 ml
Trenngelpuffer	5.00 ml
TEMED	30.0 µl
40% APS	30.0 µl

3.2.2 Sammelgel 4%

Tab. 5: Zusammensetzung Sammelgel

10.0 ml

30% Acrylamid/BIS 1.33 ml

Wasser deionisiert 5.67 ml

Sammelgelpuffer 3.00 ml

TEMED 20.0 µl

40% APS 20.0 µl

Beim Herstellen der Gele unbedingt Handschuhe tragen, da Acrylamid/BIS neurotoxisch ist.

3.3 Gele abfuellen

- Trenngel abfuellen und polymerisieren lassen
- Sammelgel abfuellen
- Kamm direkt in Sammelgel einsetzen
- Sammelgel polymerisieren lassen

3.4 Gelplatten einspannen

Nach Abfuellen der Gele werden diese in die Klemm-Haterung, welche spaeter in den Elektrophorese-Tank eingesetzt wird, eingespannt.

3.5 Laufpuffer einfuellen

Nach Einsetzen der Klemm-Halterung in den Elektrophorese-Tank wird dieser mit Laufpuffer aufgefuellt.

3.6 Gele nach Beladungsschema beladen

Tab. 6: Beladungsschema

Tasche	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
Konzentrat		LM	HM	1	2	3	4	5	6

3.7 Elektrophorese

- Sammeln bei 20 mA / Gel
- Trennen bei 40 mA / Gel

Die blaue Farblinie dient zur Orientierung. Sobald diese das Trenngel erreicht hat, wird die Stromstaerke erhoeht. Das Auftrennen der Proteine dauert insgesamt ca. 90 Minuten. Es ist darauf zu achten, dass der Strom rechtzeitig abgestellt wird. Wird die Auftrennnung nicht rechtzeitig gestoppt, laufen die Proteine nach unten in die Pufferloesung. Beim Herausnehmen der Platten Handschuhe tragen, um Fingerabdruecke auf dem Gel zu vermeiden.

3.8 Gele entnehmen

Die Gele werden aus der Halterung entommen und entsprechend gelagert:
- eingepackt in Frischhalte Folie
- bei 4 °C

4. Faerbung

4.1 Coomassie Faerbung

1. Gel 30 Minuten in der Faerbeloesung inkubieren
2. Gel 30 Minuten in Entfaerbeloesung entfaerben

4.2 Silber Faerbung

- siehe Silver Staining Protokoll

5. Gel Foto

Ein Digital-Gel Analyzer (GelDoc) ermoeglicht die Gelanalyse. Das Gel wird auf eine Transilluminator-Platte gelegt und von unten mit Weisslicht durchleuchtet. Aus dem Bild koennen qualitative und quantitative Informationen gewonnen werden.